試劑盒平衡問題，試劑盒中所有試劑和板條均應在試驗前平衡至室溫，一般需在室溫放置20-30分鐘以上。平衡時間太短會造成試劑混勻不夠，樣品孵育時間相對縮短，ELISA反應不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃的溫箱20分鐘。
加樣速度的問題，在現在的ELISA商品試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。
樣品稀釋問題，酶聯免疫反應是一種敏感性很高的反應，如果血清不稀釋，不可避免會產生很強的非特異性反應，出現假陽性。檢測血清抗體的試劑盒，均規定將血清稀釋至適當的倍數，以降低非特異性反應，使特異性的抗原抗體反應充分體現出來。一般產品的樣品稀釋倍數均通過大量試驗確定，以保證試驗的靈敏度和特異性。但有些用戶未能嚴格按使用說明書操作，如某些產品應取10μl樣品進行稀釋，個別用戶取5μl甚至1μl樣品進行稀釋，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠，因此造成樣品稀釋倍數不準確，檢測結果出現問題。
將不同廠家的試劑混用在Elisa試劑盒的問題，不同方法學的檢測試劑，會使兩對半結果出現一些不同。例如：在實際工作中常用ELISA檢測HBsAg結果為陰性，而電化學發光檢測為陽性。除方法學的靈敏度外，還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對變異抗原或亞型標志物檢測存在差異，建議試劑廠家對劑的制備應該考慮亞型及型濃度的問題。
